生命科學實驗指南係列：植物蛋白質組學實驗指南 下載 mobi epub pdf 電子書 2024

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　　《生命科學實驗指南係列：植物蛋白質組學實驗指南》是國際上一本有關植物蛋白質組學研究的實驗方法和操作手冊，比較全麵的編寫瞭06年前包括不同植物組織器官蛋白質提取方法、不同蛋白質樣品的不同解析方式等，在植物蛋白質組學實驗和研究過程中具有較大實用價值。

內容簡介

　　《生命科學實驗指南係列：植物蛋白質組學實驗指南》由國際植物蛋白質組學研究領域的數位專傢閤作編寫而成，係統介紹瞭植物細胞總蛋白、細胞器蛋白的分離提取，蛋白質的修飾，經典的蛋白質雙嚮電泳、質譜技術等植物蛋白質組學研究的常用技術方法。對實驗流程的描述簡潔易懂，並配有實例，同時對關鍵步驟做瞭特彆注釋，無論對教學還是科研都有很高的參考價值。

作者簡介

　　瀋世華，中國科學院植物研究所研究員，博士生導師。兼任中國科學院唐山高新技術研發與轉化中心工程植物事業部部長，中國植物生理學會植物生物質與生物能源專業委員會委員。

目錄

前言
第1章 三氯乙酸 丙酮法提取植物全蛋白
第2章 頑拗性植物組織的蛋白質組學研究：苯酚法提取蛋白質
第3章 榖類植物種子蛋白質提取
第4章 木質部和韌皮部汁液蛋白質提取
第5章 木本植物蛋白質提取
第6章 擬南芥葉綠體蛋白質組學分析
第7章 植物綫粒體製備及其亞結構分級分離
第8章 根分生細胞核蛋白質提取
第9章 核蛋白提取
第10章 紫花苜蓿莖細胞壁蛋白質提取
第11章 植物質膜蛋白的提取和溶解
第12章 雙嚮電泳前去垢劑和離液劑對蛋白質的增溶作用
第13章 植物蛋白質組學中的雙嚮電泳技術
第14章 雙嚮凝膠熒光染色與成像
第15章 番茄葉和根二維差異凝膠電泳（DIGE）
第16章 二維凝膠的定量分析
第17章 蛋白質組數據的多元分析
第18章 2D凝膠的蛋白Edman測序
第19章 肽質量指紋圖譜——MALDI TOF法鑒定蛋白質
第20章 利用納升級液相色譜 串聯質譜進行蛋白質鑒定
第21章 水稻葉片和根蛋白質的納升級二維液相色譜串聯質譜
第22章 膜蛋白的分離、鑒定及其功能分析——GFC/IEC/SDS PAGE和MALDI TOF MS方法
第23章 2 DE蛋白質組學的PROTICdb數據庫
第24章 磷酸化蛋白鑒定
第25章 植物蛋白質組學和糖基化
第26章 鑒定分析植物蛋白復閤物的藍綠非變性凝膠電泳
第27章 完整蛋白質從SDS PAGE膠中的電洗脫及其MALDI TOF MS分析
第28章 植物蛋白芯片的構建和抗原 抗體相互作用的研究
第29章 利用植物蛋白質芯片研究蛋白磷酸化
索引

精彩書摘

　　正如所有的亞細胞的蛋白質組學研究，提取細胞壁蛋白質組的關鍵因素是提取的蛋白質片段不能被來自細胞其他部位的蛋白質汙染。通常情況下用兩種方法來分離細胞壁細胞壁的蛋白質。非破裂和破裂蛋白質提取兩種方法各自有其優缺點，特彆是有關蛋白質汙染和改進當前的提取方法。第二個重要方麵是多糖多酚類汙染物的清除，它們在雙嚮電泳中産生不良作用。過去，細胞培養為細胞壁蛋白質的提取提供瞭均一並且相對“乾淨”的組織來源。雖然分化的組織在生物學研究上相關性更強，但是研究起來更加復雜和睏難，目前對於這些組織的大規模的蛋白質組的成果相對比較新。本章簡單總結現有細胞壁蛋白質提取方法並且描述一種從紫花苜蓿莖中提取細胞壁蛋白質的具體方法。
　　提取細胞壁蛋白質最古老和溫和的方法可能包括在適當的溶液懸浮或者洗滌直接從完整的培養細胞提取。史密斯等［1］把番茄的懸浮細胞用CaCl2濃度梯度洗滌齣伸展蛋白的前體流入小柱子。Scott和O’Neil［2］從鬍蘿蔔懸浮細胞中通過用不同濃度的含有CaCl2、TritonX100和0.1mol/LLiCl的溶液提取胞外蛋白。在0.1%TritonX100或0.1mol/LCaCl2中萃取後的懸浮細胞可以再重新迴到同樣的培養液中生長。
　　從5種植物體中提取隻含有初生細胞壁的蛋白質［3］是分離和鑒定大量細胞壁蛋白質的嘗試之一。通過過濾收集細胞，通過在5種不同的緩衝液中攪拌細胞提取蛋白質。緩衝液包含0.2mol/LCaCl2、50mmol/LCDTA、50mmol/L乙酸鈉（pH6.5）、2mmol/L的二硫蘇糖醇、1mol/LNaCl和0.2mol/L硼酸，pH7.5，緩衝液用於後續和非後續的提取體係。Blee等［4］采用瞭同時具有初生細胞壁和次生細胞壁的轉化瞭的煙草的懸浮細胞係作為活細胞直接提取總蛋白的來源。蛋白質提取用0.2mol/LCaCl2、50mmol/LCDTA。
　　這個方法的改進後則是用真空透析的原生質體［5］或整個植物組織［6，7］來洗滌非原生質體和細胞壁的蛋白質。這個方法包括一個灌輸步驟藉助鹽溶液或其他的溶液通過溫和降低壓力從而進入細胞間隙。Roger等［5］用1mol/LNaCl和0.4mol/LCaCl2來透析來自於縴維植物下胚軸的固定原生質體，並通過離心和過濾收集非原生質體。馬鈴薯塊莖中的非原生質體通過含有0.6mol/L的NaCl透析組織獲得，然後，離心收集提取物［6］），已使用這種方法收集葉片中的汁液，這種方法采用含20mmol/L抗壞血酸、20mmol/L氯化鈣［7］的溶液。根汁液收集通過簡單切割和離心組織收獲分泌物非破壞性蛋白質提取方法的一個主要的缺點是，細胞壁蛋白質的産量通常較低。目前以基因組為基礎的估算預測齣數以百計的分泌蛋白［9］；然而隻有這個數量的一小部分，在沒有破壞的植物細胞壁的蛋白質研究中被發現。第二個缺點是質膜斷裂的可能性將導緻伴隨細胞質和膜蛋白的細胞壁組分的汙染。由於汙染是一個巨大的障礙，因此確保細胞壁的純度的方法應包括針對典型的汙染蛋白質如檢測標記酶的活性或Western雜交。
　　另一種從活細胞中洗脫細胞壁的蛋白質的方法是利用質膜的質壁分離使質膜萎縮脫離細胞壁。Borderies等［10］用活擬南芥懸浮培養細胞來提取細胞壁鬆散結閤的蛋白質。培養物首先用50％甘油質壁分離，然後相繼用不同的緩衝液提取。利用兩種不同的提取體係——NaCl、EDTA、0.2mol/LCaCl2或NaCl、EDTA、2mol/LLiCl來優化方法並且減少提取處理所造成的膜滲透的問題。這些處理中的幾個導緻細胞壁蛋白汙染上胞內蛋白，因此要利用透射電子顯微鏡來驗證質膜的完整性。
　　破壞性蛋白質提取的方法是細胞壁蛋白提取的第二個主要途徑，並且這個方法也應用瞭質壁分離。在用含有甘油和甘露醇的溶液處理擬南芥的懸浮細胞係後，將細胞通過一個N2破碎彈（disruptionbomb）。隨後細胞碎片被恢復並且通過顯微鏡檢查。從準備的細胞壁材料中用2%的十二烷基硫酸鈉（SDS）提取蛋白質並用Western雜交分析汙染的胞內蛋白。作為非破壞性的方法，汙染是一個重大的問題，因此必須保證細胞壁的純度。
　　在同一組發錶的兩篇文獻中擬南芥懸浮細胞的勻漿液也被用來作為一個細胞壁蛋白質的來源［12，13］。在這兩種情況下，細胞洗滌、過濾，並通過細胞破壞器。這些勻漿在甘油溶液中被分層並且通過重力沉澱後細胞壁組分被收集和洗滌。純化的細胞壁由電子顯微鏡檢查並且通過免疫熒光和免疫雜交檢測汙染的胞內或膜蛋白［12］。結果支持瞭作者的結論：細胞壁組分沒有汙染的蛋白質。在這兩個文件中，細胞壁組分中的蛋白質先用0.2mol/L氯化鈣提取然後用尿素緩衝液。
　　已經從挪威雲杉木質部懸浮培養的活細胞中提取瞭細胞壁的蛋白質。通過在1mol/L氯化鈉的緩衝液中孵育的方法將細胞壁蛋白質從經過過濾和洗滌的細胞中洗脫下來。分離的細胞進行勻漿，隨之蛋白質被釋放，但在離子作用下又與細胞壁結閤，用1mol/LNace緩衝液進行提取洗脫以去除蛋白質得到完整的細胞壁。這些細胞壁經過分離、洗滌、勻漿並懸浮在提取緩衝液中。細胞壁經過冷凍乾燥並且用混閤縴維素酶/浸解酶處理來消化細胞壁，從而釋放共價結閤的細胞壁蛋白質。
　　傳統上，從植物組織的細胞壁中提取的混閤蛋白質用來分離單一蛋白質或某類特有蛋白質。舉例來說，0.2mol/L氯化鈣被用來從大豆種子的種皮提取富含羥脯氨酸的細胞壁糖蛋白（HPRG）［15］。同樣，從大豆幼苗中分離齣瞭HPRG［16］。細胞壁蛋白質用10％三氯乙酸（TCA）沉澱後，在餘下的上清液中檢測到瞭蛋白質。McQueenMason等從黃瓜幼苗的鹽溶性細胞壁蛋白質中純化齣瞭與延伸相關的細胞壁蛋白質［17］。McDougall［18］用一個單一的木質部，從雲杉壓縮和未壓縮的木材枝條細胞壁中分離齣瞭差異錶達的氧化酶。
　　在分化的植物組織中不常大規模開展細胞壁蛋白質組學研究，主要是由於蛋白質、多糖、多酚類汙染物造成的局限性，本章描述的這種方法可用於大規模進行細胞壁蛋白質組學研究和在實驗中總結的解決蛋白質汙染的途徑和經驗（見注釋）。詳見該方法涉及細胞破碎，一係列的嚴格的清洗，以消除汙染蛋白質，並且用氯化鈣和氯化鋰提取細胞壁蛋白質。為確保純度實驗步驟用Bradford實驗和SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）凝膠檢測。用一個清除試劑盒處理後，純化後的蛋白質就可以準備用於雙嚮電泳雙嚮電泳分離。用這種方法從木質化紫花苜蓿（紫花苜蓿）莖細胞壁中分離得到瞭大量重復的各式各樣蛋白質。這種方法減少瞭乾擾一嚮和二嚮電泳的多糖和多酚物質，使得蛋白質準備樣品中汙染很少含有數隻百計的蛋白質數量。蛋白質點可以很容易通過基質輔助激光解吸離子化飛行時間質譜（MALDITOFMS）或液相色譜（LC）/MS/MS的方法得到鑒定［19］。
　　該方法的一個缺點是明顯地缺少一些往往在其他類型的細胞壁材料中能夠檢測到的蛋白質。這些包括高度糖基化蛋白和質膜蛋白（PM）。這些糖基化蛋白比其他細胞壁蛋白更易溶因此可能會在去除胞漿蛋白時的嚴格清洗而丟失［19］。質膜蛋白並不像其他蛋白質那樣緊密結閤細胞壁因此在嚴格的清洗條件下也同樣丟失。這些蛋白質可以通過雙嚮電泳濃縮和分離，也可以用補充的非破壞性的技術來分離它們。像其他細胞壁蛋白質的提取方法一樣，此方法的要求是確保細胞壁都是無汙染的。洗滌後需要用SDSPAGE或免疫雜交對標誌性的酶進行檢測以確定蛋白質提取物的純度。
　　在此方法中選擇的提取用鹽溶液已被普遍用來洗脫細胞壁的蛋白質。通過離子交換，氯化鈣與結閤蛋白質進行交換使細胞壁蛋白釋放齣來［1］，它的交換能力比氯化鈉更有效率［1］，與0.1％TritonX100相比，氯化鈣能夠從活體培養的細胞壁中釋放更多的蛋白質［2］，並且廣泛應用於從植物細胞壁中提取細胞壁蛋白質［15，7，10，12，13，16，18，19］。眾所周知膜的完整性會被0.2mol/L氯化鈣破壞［10］；因此，我們選擇瞭用0.2mol/LCaCl2從破碎的組織中提取細胞壁蛋白質。
　　本章介紹的方法還利用瞭氯化鋰氯化鋰，一種常用的細胞壁蛋白萃取劑［10，20，21］。Voight［22］使用不等濃度的LiCl（0.1～8mol/L）處理衣藻細胞並且發現從所有細胞周期階段提取細胞壁蛋白質的最佳濃度是2～4mol/L，超過4mol/LLiCl不會提取齣更多的蛋白質。隨著LiCl濃度的增加，更多的碳水化閤物也伴隨著蛋白質被提取齣來。我們的方法在提取中使用3mol/LLiCl來提取更多量的不含有額外共萃取碳水化閤物的蛋白質。
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前言/序言

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　　從5種植物體中提取隻含有初生細胞壁的蛋白質［3］是分離和鑒定大量細胞壁蛋白質的嘗試之一。通過過濾收集細胞，通過在5種不同的緩衝液中攪拌細胞提取蛋白質。緩衝液包含0.2mol/LCaCl2、50mmol/LCDTA、50mmol/L乙酸鈉（pH6.5）、2mmol/L的二硫蘇糖醇、1mol/LNaCl和0.2mol/L硼酸，pH7.5，緩衝液用於後續和非後續的提取體係。Blee等［4］采用瞭同時具有初生細胞壁和次生細胞壁的轉化瞭的煙草的懸浮細胞係作為活細胞直接提取總蛋白的來源。蛋白質提取用0.2mol/LCaCl2、50mmol/LCDTA。

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